基于线粒体cox2基因的细粒棘球绦虫RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

周愉乐; 唐文强; 李鑫; 石斌; 赵霞玲; 马艳; 炊文婷; 黄福强; 《中国预防兽医学报 》 2025 北大核心 CSCD

摘要：为建立灵敏、特异的细粒棘球绦虫即时核酸检测方法，本研究结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）和CRISPR/Cas12a系统，以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基2(cox2)基因为靶标，设计5条RPA正向引物和5条反向引物，并根据确定的原间隔相邻基序（PAM）设计合成7条CRISPR RNA(crRNA:cox2-1/2/3/4/5/6/7)，初步建立了细粒棘球绦虫RPA-CRISPR/Cas12a单管检测方法，并通过荧光结果筛选出最佳RPA扩增引物及最佳crRNA。利用建立的方法分别检测细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、带状泡尾绦虫、贝氏莫尼茨绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫和肝片吸虫共7种寄生虫DNA，评估该方法的特异性，结果显示，该方法仅可特异性检测细粒棘球绦虫DNA，其他寄生虫DNA检测结果均为阴性，且可在20 min内得到检测结果；将重组质粒标准品稀释至1 000拷贝/μL、500拷贝/μL、100拷贝/μL、50拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL，分别作为模板经建立的方法检测，结果显示，该方法对重组质粒标准品的检测限可达50拷贝/μL；以检测限浓度的质粒标准品为模板，采用所建立的方法于不同时间检测，每次做两组平行对照，共做3次，评估该方法的重复性，结果显示，6组试验的荧光值差异较小。表明本研究建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法对62份临床犬粪便样品检测，结果显示细粒棘球绦虫的阳性率约为0.16%(1/62)，与qPCR的检测结果相符。本研究建立了RPA-CRISPR/Cas12a单管检测方法，并对次优PAM和次优结构的crRNA进行了优化，该方法可在短时间内完成特异、灵敏地检测，有望成为细粒棘球绦虫终末宿主现场筛查的新型替代检测工具。

关键词： 细粒棘球绦虫 核酸扩增检测 重组酶聚合酶扩增技术 CRISPR/Cas12a crRNA cox2基因