科研产出
1株羊源伪结核棒状杆菌的分离鉴定及耐药性分析
《中国畜牧兽医 》 2025 北大核心
摘要：【目的】确定云南宜良地区某养殖场疑似患伪结核病病羊的病原，并探究其耐药性及致病性，为该病的诊断和治疗提供理论依据。【方法】通过患病羊临床症状初步判断病因，无菌采集病料，分离纯化病原菌后对其形态特征、培养特性和生化特性进行鉴定；利用PCR扩增分离株16S rRNA基因序列并进行测序比对分析；通过药敏试验、耐药基因检测和小鼠致病性试验探究分离株的耐药性和致病性。【结果】分离株在血琼脂平板上生长状态良好，菌落呈黄白色、不透明样，在普通营养琼脂和普通营养肉汤内生长不良；革兰染色镜检结果显示，菌体为球杆状或棒状，为革兰阳性菌。生化鉴定结果显示，分离株的葡萄糖、尿素试验呈阳性，乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、西蒙氏枸橼酸盐、硫化氢、靛基质、硝酸盐还原试验、甲基红（MR）试验和VP试验均呈阴性。16S rRNA序列比对结果显示，分离株与NCBI数据库中的伪结核棒状杆菌16S rRNA基因序列相似性>99%,鉴定其为伪结核棒状杆菌。药敏试验结果显示，分离株对链霉素、庆大霉素、新霉素表现中介，对氨曲南、头孢他啶、多黏菌素表现耐药。耐药基因检测结果显示，该分离株携带耐药基因Sul2、Sul3、blaTEM及blaCTX-M。动物致病性试验结果显示，腹腔、皮下接种4.4×10～8 CFU/mL分离菌后可引起小鼠死亡，死亡率达100%。皮下接种96 h后可见小鼠皮下出现脓肿，脓液中可分离出伪结核棒状杆菌。【结论】本试验成功分离鉴定出1株羊源伪结核棒状杆菌，明确了患病羊病原，该分离株对小鼠致病性较强。研究结果为伪结核棒状杆菌感染羊的诊断、流行病学调查以及治疗提供参考依据。
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山羊原代口腔上皮细胞的分离培养及鉴定
《动物医学进展 》 2025 北大核心 CSCD
摘要：建立一种高效制备山羊原代口腔上皮细胞的体外分离培养方法，为后续研究山羊口腔疾病提供细胞材料。试验采用0.1μg/mL分散酶Ⅱ和300 U/mL胶原酶Ⅰ组合消化法、组织贴壁法分离纯化山羊口腔上皮细胞，用含10%胎牛血清和10 ng/mL表皮生长因子(EGF)完全培养基培养口腔上皮细胞，观察其形态特征并记录生长曲线，经过特异性蛋白PCR扩增、免疫荧光、质粒pGEFP-N1转染进行口腔上皮细胞的鉴定。结果表明，组合酶消化法后细胞基本贴壁，细胞形态正常，呈铺路石状，可见有成纤维细胞夹杂生长；组织贴壁法48 h后逐渐爬出细胞，呈铺路石状，无杂细胞夹杂生长；原代口腔上皮细胞分离后采用CCK-8试剂盒对细胞活力进行检测，表明1～3 d增殖速度缓慢，培养3～5 d细胞增殖速度加快，活性增强，进入对数生长期，培养5～7 d后细胞增殖速率下降，原代口腔上皮细胞生长曲线呈S形；使用角蛋白、肌间线蛋白、波形蛋白特异性引物对分离到的山羊口腔上皮细胞进行PCR扩增，扩增结果表明所分离纯化得到的细胞是口腔上皮细胞；免疫荧光染色结果显示角蛋白抗体免疫阳性率达98%以上；质粒pEGFP-N1转染口腔上皮细胞12 h荧光较弱，24 h荧光增强，阴性无荧光，表明山羊原代口腔上皮细胞可整合外源基因并作为表达外源基因的生物反应器。建立了山羊原代口腔上皮细胞体外分离培养方法。
关键词： 山羊口腔上皮细胞 原代培养 分离鉴定 胶原酶消化法
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藏羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定与药物敏感性分析
《中国畜牧兽医 》 2025 北大核心
摘要：[目的]对采集自西藏拉萨市曲水县疑似产气荚膜梭菌感染致死病例进行病原检测并进行体外药物敏感性分析.[方法]无菌采集病死藏羊肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、血液、胃内容物、肠内容物等12份病料样品,通过厌氧培养进行病原菌的分离培养和纯化,对分离纯化后的菌株进行革兰染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因PCR鉴定,并进行基因序列测定和遗传进化分析,通过PCR检测分离株的毒素基因携带情况并进行毒素分型,进一步开展分离株的体外药物敏感性研究.[结果]试验从12份藏羊病料样品中分离获得10株疑似菌,分离株在RMC培养基中生长旺盛,在TSC培养基中呈中间黑、边缘白的菌落,在5%脱纤维绵羊血平板上呈现双溶血环,革兰染色为阳性杆菌,初步判定为产气荚模梭菌,命名为QS-1~QS-10.生化鉴定结果显示,分离株乳糖、蔗糖、D-核糖、鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖、木糖、甘露醇、山梨醇、明胶、尿素、牛乳发酵试验呈阳性,松三糖、棉子糖、阿拉伯糖、M-R、V-P、甘油、水杨苷、硫化氢、过氧化氢、尿素、吲哚试验结果呈阴性.分离株16S rRNA基因序列与产气荚膜梭菌参考株的相似性为98.30%~99.90%,与产气荚膜梭菌参考株处于同一分支,而与大肠杆菌、沙门菌等处于不同分支.毒素基因检测结果显示,8株分离株仅携带cpa基因,为A型产气荚膜梭菌;2株分离株携带cpa和etx基因,为D型产气荚膜梭菌.分离株均对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林表现敏感或中介,对其余15种药物均存在不同程度的耐药性,其中9株存在多重耐药性,5重以上耐药的菌株占80.00%,分离株QS-3耐药数量多达13种.[结论]本研究从猝死藏羊病料中分离出10株产气荚膜梭菌,其中2株为D型、8株为A型,分离株耐药情况严重.研究结果为当地藏羊产气荚膜梭菌病的治疗和预防提供了数据指导.
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牦牛源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性研究
《中国畜牧兽医 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：[目的]2023年4月至2023年5月,西藏拉萨市多地出现牦牛严重腹泻、便血甚至死亡的现象.试验旨在确定牦牛腹泻的病原菌并研究其生物学特性,以期为该地区牦牛腹泻病的防治提供参考.[方法]采集新鲜牦牛腹泻粪便样品进行厌氧培养,通过培养特性及染色镜检进行初步鉴定;对可疑阳性菌株进行生化特性、多重PCR毒素基因分型及cpe、netB、cpb2毒素鉴定,并进行cpa、cpb2、16S rRNA基因的遗传进化分析、部分分离株生长曲线测定及动物致病性试验;采用K-B法测定分离株的体外药物敏感性,统计不同分离株的多重耐药结果.[结果]从样品中分离纯化得到8株分离菌,在厌氧培养基中生长旺盛,在TSC培养基、5%脱纤维绵羊血平板、卵黄琼脂培养基上均呈现与产气荚膜梭菌相似的典型菌落,革兰染色为紫色大杆菌,初步判定为产气荚膜梭菌,命名为XZ-1~XZ-8.分离株生化检测结果与产气荚膜梭菌相符;分离株均携带cpa和cpb2基因,为A型产气荚膜梭菌;16S rRNA基因分析结果显示,8株分离株与产气荚膜梭菌参考株的相似性为97.3%~100%,在系统进化树中处于同一分支,而与屎肠球菌、大肠杆菌参考株处于不同分支;分离株cpa和cpb2基因存在一定的变异性.生长曲线显示,3株分离株(XZ-1、XZ-4、XZ-7)生长规律基本一致,其中0~4 h为迟缓期,4~8 h为对数期,8~22 h为稳定期,22 h后开始进入衰亡期.动物致病性试验结果显示,分离株对昆明小鼠具有较强的致病性.分离株对苯唑西林、红霉素、氯霉素、氧氟沙星、米诺环素、头孢哌酮、利福平及罗红霉素敏感,对青霉素、哌拉西林、羧苄西林、麦迪霉素、头孢曲松等22种药物均存在不同程度的耐药性,存在多重耐药性,其中XZ-7株耐药数量多达11种,6重以上耐药的菌株占75.0%.[结论]本研究成功从拉萨严重腹泻、血便牦牛粪样中分离出8株A型产气荚膜梭菌,分离株对小鼠具有较强的致病性,对青霉素、哌拉西林、羧苄西林等药物存在不同程度的耐药性.研究结果为该地区牦牛腹泻病防控提供了参考依据.
关键词： 牦牛 产气荚膜梭菌 分离鉴定 生长曲线 动物致病性 耐药性
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一株西藏牦牛源格氏乳球菌的分离鉴定
《西藏农业科技 》 2024
摘要：为了弄清引起西藏牦牛乳腺炎的病原，采集患有乳腺炎的牦牛乳汁样品进行细菌培养，将分离到的1株细菌命名为XZ-1并进行染色镜检和16S rRNA基因扩增、比对，从GenBank上下载相似性最高细菌的16S rRNA基因，采用DNA Star软件进行同源性和遗传进化分析。结果显示，分离株细菌革兰氏染色，镜检为阳性，散在或成双或短链排列的球状菌；16S rRNA基因比对表明，与GenBank中格氏乳球菌的相似性达到99.43%～99.93%，与格氏乳球菌参考株的同源性为99.5%～100%；遗传进化分析表明，西藏分离株XZ-1与格氏乳球菌参考株形成一个大的分支，且与格氏乳球菌SCH和MS4-2参考株亲缘关系较近，聚为一簇。研究表明，该分离株为格氏乳球菌，是引起乳腺炎的病原之一，为今后开展牦牛乳腺炎病原及格氏乳球菌的研究提供参考依据。
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牦牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及生物学特性研究
《中国人兽共患病学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：目的 了解拉萨市和那曲市部分地区牦牛源金黄色葡萄球菌的致病性、毒力基因和耐药基因的携带情况及耐药性，为拉萨市和那曲市牦牛金黄色葡萄球菌感染治疗提供参考。方法 从55份牦牛鼻拭子样品中进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定，并采用PCR法、人工感染小鼠及K-B药敏纸片法对所分离的金黄色葡萄球菌开展毒力基因和耐药基因的携带情况、致病性和药物敏感性检测。结果 55份牦牛鼻拭子样品中分离到7株金黄色葡萄球菌，分离率为12.73%,分离菌株对小鼠均具有致病性，致死率60%以上，7株金黄色葡萄球菌携带3种耐药基因(tetM、tetK和mecA)和6种毒力基因(seb、sec、clfA、hla、hlb和nuc),3种耐药基因检出率为100%,6种毒力基因的检出率在83.33%～100%,分离菌株对青霉素、氨苄西林和复方新诺明的耐药率达85.71%～100%,且对四环素和头孢他啶的耐药率均为28.57%。结论 拉萨市和那曲市的牦牛存在金黄色葡萄球菌的感染，且感染菌株携带多种耐药基因和毒力基因，并具有较强致病性，对大部分抗菌药敏感。
关键词： 金黄色葡萄球菌 分离鉴定 毒力基因和耐药基因 药敏试验
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牦牛乳源产色葡萄球菌的分离鉴定及毒力与耐药性分析
《中国畜牧兽医 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：[目的]了解西藏拉萨、那曲地区牦牛乳源产色葡萄球菌的耐药性,并探究其携带毒力基因和耐药基因情况.[方法]从牦牛乳汁中分离培养产色葡萄球菌,并分析其生化特性,通过PCR方法进行分子生物学鉴定并对分离株携带的毒力基因和耐药基因进行检测,采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验.[结果]从66份牦牛乳汁中分离鉴定出11株产色葡萄球菌,分离率为16.67%.分离株在5%脱纤维绵羊鲜血琼脂培养基上形成边缘整齐、圆润、光滑、不透明的乳白色菌落,无溶血现象;革兰染色镜检可见呈念珠状排布的阳性球菌.生化鉴定结果显示,分离菌可发酵果糖、乳糖、甘露糖与蔗糖,硝酸盐还原反应呈阳性.16S rRNA扩增测序对比结果显示,分离菌与GenBank中的其他产色葡萄球菌相似性>98%.13种毒力基因中检出icaA、bap 2种生物膜相关调控基因,检出率均为81.82%;14种耐药基因中,耐氨基糖苷类基因aph(3')-Ⅰa、耐大环内酯类基因ermB、耐磺胺类基因sul1的检出率分别为63.64%、27.27%和9.09%.分离株对青霉素、氨苄西林和四环素耐药率分别为100.00%、63.64%和36.36%.[结论]本研究从采集自拉萨、那曲两地的66份牦牛乳样中共分离获得11株产色葡萄球菌,分离株对青霉素、氨苄西林、四环素等常见抗菌药存在不同程度的耐药性,其携带的毒力基因与耐药基因种类较少.研究结果为牦牛产色葡萄球菌的防治提供了理论依据.
关键词： 牦牛乳 产色葡萄球菌 分离鉴定 毒力基因 耐药基因
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1株牦牛源A∶L3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及致病性分析
《中国畜牧兽医 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：[目的]探究西藏阿里地区某养殖场内牦牛发病和死亡病因,分析其病原菌生物学特性,为有效防治该病提供参考.[方法]无菌采集死亡牦牛病变组织,根据临床症状进行实验室诊断并分离培养病原菌.通过形态学观察、生化鉴定、16S rRNA PCR扩增并测序、kmt基因鉴定、荚膜血清分型、脂多糖分型对分离株进行鉴定,并探究分离株的药物敏感性和致病性.[结果]分离株在7%血清TSA培养基中长出灰白色、透明、露滴样菌落;革兰染色镜检可见两端浓染的革兰阴性短杆菌.生化鉴定结果显示,分离株在葡萄糖、鸟氨酸脱羧酶、氧化酶、山梨醇和甘露醇生化反应管中呈阳性.荚膜血清分型及脂多糖分型结果显示,分离株为多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型脂多糖L3型.药敏试验结果显示,分离株对羧苄西林、氨苄西林、头孢唑林、庆大霉素、呋喃妥因、头孢呋辛、丁胺卡那、米诺环素和诺氟沙星均表现敏感.致病性试验结果显示,小鼠腹腔注射0.2 mL 1×108 CFU/mL分离株菌液后,死亡率为100%(5/5),分离株具有较强致病性.[结论]本研究成功分离鉴定出1株血清A型脂多糖L3型多杀性巴氏杆菌,其对羧苄西林、氨苄西林、头孢唑林等药物敏感,致病性较强.研究结果为探究牦牛源多杀性巴氏杆菌的生物学信息和病原学特征提供了数据参考.
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西藏牦牛腹泻性大肠杆菌的分离鉴定
《甘肃畜牧兽医 》 2023
摘要：为探讨西藏那曲市申扎县牦牛腹泻的原因，本试验无菌采集11份腹泻牦牛粪便样品进行细菌分离培养、染色镜检，对检测菌株的16Sr RNA基因进行扩增、测序，序列上传至Gen Bank进行比对，并使用DNAStar进行同源性分析，构建遗传进化树。分离结果表明，11份样品中共分离出5株菌株，在MAC培养基上菌落呈粉红色，革兰氏染色镜检后发现所有菌株均为阴性且两端钝圆的直杆菌；16Sr RNA基因同源性分析结果显示，5株分离株16Sr RNA序列同源性在90%以上，与大肠杆菌参考序列的同源性达到95.2%以上；遗传进化树显示，XZ-1、XZ-5分离株与大肠杆菌AT125株、PAK/SA4株亲缘关系较近，XZ-2、XZ-3和XZ-4分离株与大肠杆菌RM13322株亲缘关系较近，经以上鉴定可知分离菌为大肠杆菌。
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牦牛源地衣芽孢杆菌的分离鉴定
《西藏农业科技 》 2023
摘要：为分离西藏牦牛源地衣芽孢杆菌并研究其生物学特性，为今后开发相关益生菌及其制剂奠定基础，采集西藏牦牛粪便，从粪便中分离培养、纯化病原菌，通过染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增、同源性分析、进化树构建等对分离株进行鉴定且对分离株进行耐药性试验。结果从样品中分离到3株地衣芽孢杆菌，革兰氏阳性杆菌，分别命名为XZ-1,XZ-2,XZ-3。3株分离株生化检测结果一致：可分解甘露醇、淀粉、阿拉伯糖，可还原硝酸盐，V-P试验呈阳性，不能水解明胶，不能产生红色吲哚。分离株16S rRNA PCR扩增产物电泳结果与预期结果一致，长度为1 500 bp左右。3株分离株之间同源性为96.0%～99.9%，与地衣芽孢杆菌分离株的同源性为98.3%～100%;3株分离株与地衣芽孢杆菌处于同一支，而与链球菌其他种属芽孢杆菌处于不同分支。分离株XZ-1对青霉素、氨苄西林耐药，对林可霉素中度敏感，对头孢曲松、四环素、红霉素、恩诺沙星、氯霉素、环丙沙星、阿莫西林敏感；分离株XZ-2对青霉素、氨苄西林、四环素、林可霉素耐药，对氯霉素中度敏感，对头孢曲松、红霉素、恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林敏感；分离株XZ-3对青霉素耐药，对氨苄西林、对林可霉素中度敏感，对头孢曲松、四环素、红霉素、恩诺沙星、氯霉素、环丙沙星、阿莫西林敏感。
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