基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的建立

淦雨洁; 董青霜; 张阳; 何佳蔚; 王冬经; 冯志新; 王佳; 周可心; 丁红雷; 《生物工程学报 》 2024 北大核心 CSCD

摘要：本研究拟建立一种高特异性的猪肺炎支原体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测方法。首先，构建重组菌大肠杆菌BL21(DE3)-p ET-32a(+)-mhp336，诱导重组蛋白Mhp336表达并纯化，获得的纯化蛋白作为包被抗原；然后，确定ELISA方法的抗原包被浓度、封闭液和封闭时间、血清和二抗稀释比例和孵育时间、显色时间和判定标准；之后进行重复性试验、与猪的其他主要病原抗血清的交叉反应性和确定血清最大稀释倍数；最后，用建立的方法检测226份猪血清样品，并与商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法进行比较，确定检测方法的灵敏性和特异性。最终确定Mhp336纯化蛋白的最佳包被浓度为0.05μg/m L，封闭液为含2.5%脱脂奶粉的PBS，封闭时间为1 h，血清稀释比例为1:500，孵育时间为0.5 h，二抗稀释比例为1:10 000，孵育时间为1 h，显色时间为5 min。检测方法的cut off值为0.332。试剂盒的批内和批间变异系数均低于7%。猪血清样品的检测结果表明，本研究建立的检测方法的灵敏性和特异性均优于商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法。本研究成功建立了基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法，灵敏性和特异性均较好，为猪场猪支原体肺炎的净化提供了检测方法。

关键词： 猪肺炎支原体 原核表达 灵敏性 特异性 临床样品