基于CRISPR-Cas基因检测技术的FecB基因快速筛选方法研究及Cas核酸酶性能测定

潘东霞; 王辉; 贺越; 平措班旦; 木卡地斯·米吉提; 熊本海; 唐湘方; 《中国畜牧杂志 》 2024 北大核心 CSCD

摘要：基于CRISPR-Cas系统的新型基因检测技术对核酸序列碱基突变检测分析具有独特的优势，但目前对单个碱基突变检测过程中的灵敏性和特异性研究较少。为此，本研究针对小尾寒羊中具有单碱基突变的多羔基因FecB进行研究，探究CRISPR-Cas系统对其检测的灵敏性和特异性。试验以小尾寒羊个体作为试验动物，提取基因组DNA，通过PCR扩增BB、++、B+型的基因序列为底物。基于Cas核酸酶的体外定点内切酶活性，针对FecB基因BB型基因序列设计了3种Cas9核酸酶sgRNA和1种Cas12a核酸酶crRNA，利用CRISPRCas9和CRISPR-Cas12a系统对不同基因型目标序列进行酶切检验，并探究Cas核酸酶的切割性能。结果表明：3种基因型的靶DNA均被切割为250 bp和100 bp 2个片段；Cas核酸酶切割性能检测结果显示，缩短酶切反应时间对提高Cas核酸酶切割特异性没有影响，降低Cas核酸酶和sgRNA浓度影响切割效率，但是不能有效改善Cas核酸酶的切割特异性，对区分FecB基因BB、++、B+基因型没有影响。本研究试验结果表明Cas核酸酶具有较高的切割稳定性和切割灵敏性，但其特异性是复杂的，受多种因素影响，且sgRNA/crRNA与靶DNA的互补配对有一定的容错性，存在单碱基错配不影响Cas核酸酶的切割活性，不能有效区分绵羊FecB基因型。本研究揭示了影响Cas核酸酶切割特异性的多重因素，为后续优化CRISPR-Cas系统中核酸酶和sgRNA/crRNA设计提供了理论基础，有助于提高基因组编辑的特异性和效率。

关键词： CRISPR-Cas系统 单碱基突变 检测性能 FecB突变 基因分型